TU Ilmenau Humbold Bau

Projektdaten



FOR 2625 Mechanismen der Lysosomalen Homöostase, TP 3


Hochschule
Universitätsklinikum Jena
Fakultät/Einrichtung
Medizinische Fakultät
Förderkategorie
DFG
Zeitraum
2020 - 2023
Drittmittelgeber
Deutsche Forschungsgemeinschaft
Bewilligungssumme, Auftragssumme
368.746,00 €

Abstract:

Hereditäre spastische Paraplegien (HSP) sind durch eine fortschreitende spastische Gangstörung aufgrund einer längenabhängigen Degeneration der Axone kortikaler Motoneurone gekennzeichnet. Es können verschiedene genetische HSP-Entitäten (SPGs) unterschieden werden. SPG48 wird durch Mutationen im AP5Z1-Gen verursacht. Das Protein Ap5z1 kopräzipitiert zusammen mit 5 anderen Proteinen, u.a. Spatacsin und Spastizin, die mit den HSP-Subtypen SPG11 bzw. SPG15 assoziiert sind. Dieser Proteinkomplex wurde später als neuer Adapterproteinkomplex (AP-5) mit Spatacsin und Spastizin als mögliche Gerüstproteine und Ap5z1 als Untereinheit identifiziert. Jüngste Erkenntnisse weisen darauf hin, dass AP-5 ähnlich wie der Retromer-Komplex am Transport von Membranproteinen zwischen Endosomen und dem trans-Golgi-Netzwerk (TGN) beteiligt ist. Als Frachtrezeptoren wurden der kationenunabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CI-MPR) und Sortilin identifiziert, die mit Spastizin interagieren. Wir konnten in der ersten Förderperiode zeigen, dass Ap5z1-KO-Mäuse eine progressive spastische Gangstörung entwickeln, die durch eine progressive Akkumulation von intraneuronalem autofluoreszierendem Material und Axondegeneration gekennzeichnet ist. Embryonale KO-Mausfibroblasten zeigten strukturelle Veränderungen des Golgi-Apparates sowie Autophagiedefekte unter Stressbedingungen. Als mögliche Ursache fanden wir ein gestörtes Recycling von Lysosomen aus Autolysosomen. Außerdem fanden wir eine massiv gestörte Verteilung der Phosphatidyl-4-Kinase-2-alpha (Pi4k2a) in Ap5z1-KO-Mäusen. Da Pi4k2a ein Schlüsselenzym für die Produktion von Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI(4)P) ist, das eine wichtige Rolle bei verschiedenen Membrantransportvorgängen sowie Exozytose und Autophagie spielt, vermuten wir, dass die gestörte Expression und Lokalisation von Pi4k2a für viele der beobachteten zellulären Defekte ursächlich sein könnte. Daher wollen wir die subzelluläre Verteilung von Pi4k2a und seinem Produkt PI(4)P nun im Detail untersuchen. Um zu verstehen, warum der Verlust von Ap5z1 zu einer Umverteilung von Pi4k2a führt, ist es außerdem wichtig, AP-5 zuverlässig in lebenden Zellen zu lokalisieren. Dazu werden wir Zellklone mit einer fluoreszenzmarkierten Untereinheit von AP-5 erzeugen und die Lokalisation unter Standardbedingungen und nach Aushungern der Zellen untersuchen. Um weitere Hinweise auf mögliche Frachtrezeptoren zu erhalten, werden wir mithilfe dieser Zelllinien auch Pulldown-Assays und einen TurboID-Ansatz durchführen. Außerdem wollen wir klären, welche Konsequenzen die Überexpression, die Herunterregulation, der KO oder die pharmakologische Hemmung von Pi4k2a auf Autophagie, die Lysosomenfunktion und das Recycling von Lysosomen hat.
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